Введение.
Саркоидоз – воспалительное заболевание неизвестной этиологии, характеризующееся формированием эпителиоидно-клеточных гранулём без некроза, мультисистемным поражением различных органов и тканей, преимущественно внутригрудных лимфатических узлов, легких, реже других органов [1, 2]. 
Развитие саркоидоза является следствием взаимодействия экзогенных, окончательно не установленных, факторов на организм человека, и генетической предрасположенности к формированию избыточно сильных иммунных ответов на такие факторы. 
При саркоидозе происходит гиперактивация клеток иммунной системы, продуцируемые цитокины и хемокины играют важную роль в процессе гранулемообразования [40]. Согласно современным представлениям, клеточно-опосредованные реакции являются основными в патогенезе саркоидоза. В развитии таких реакций участвуют разные субпопуляции Т-хелперов: 1 типа (Th1), 17 типа (Тh17), а также относительно недавно описанные «неклассические», «пластичные» субпопуляции Т-хелперов: Тh1/Тh17 и Тh17.1 [20, 37, 40]. Считают, что именно «неклассические», субпопуляции Т-хелперов во многом определяют характер клинического течения саркоидоза благодаря их способности активировать макрофаги и нейтрофилы в очаге воспаления [12, 40, 43].  
Эффективность механизмов сдерживания избыточно сильных иммунных реакций при саркоидозе, как и при других заболеваниях, определяется поддержанием баланса активности провоспалительных субпопуляций Т-хелперов (Th1/Th17/Th17) и Т-хелперов с иммунорегуляторными свойствами - так называемых Т-регуляторных лимфоцитов (Tregs) [24, 32, 40].  
Роль гуморальных механизмов в патогенезе саркоидоза менее изучена по сравнению с клеточно-опосредованными. Повышенные уровни IgG-антител к ряду аутоантигенов (к циклическим цитруллинированным пептидам, антинуклеарные антитела, антитела к двуспиральной ДНК и ряд других) могут определяться в сыворотке крови и бронхоальвеолярном лаваже больных саркоидозом [28, 29, 46]. Эти и другие данные свидетельствуют о том, что наряду с клеточно-опосредованными реакциями, в патогенезе саркоидоза могут принимать участие и циркулирующие аутоантитела, преимущественно класса IgG [12, 23, 40]. В других работах, напротив, указывают на отсутствие отличий уровней IgG-антител у больных саркоидозом и у здоровых лиц [8, 25]. Таким образом, в настоящее время роль гуморальных механизмов в патогенезе саркоидоза окончательно не ясна.
Какова же роль активации или, напротив, анергии В-звена иммунитета при саркоидозе?  Вероятно, это во многом коррелирует с особенностями клинического течения заболевания. При активном течении саркоидоза, характеризующимся лучшим прогнозом и возможностью спонтанной ремиссии, в периферической крови больных отмечается повышенное содержание «переходных» субпопуляций В-лимфоцитов и «регуляторных» В-лимфоцитов, продуцирующих IL-10 [41].  При тяжелом прогрессирующем течении саркоидоза в периферической крови больных отмечается   анергия В-лимфоцитов, В-клеточная лимфопения и существенное снижение числа В-клеток памяти [31]. 
Результаты гистологического исследования биопсионных образцов легочной ткани у больных саркоидозом при остром и при хроническом течении заболевания, свидетельствуют о присутствии в гранулемах   В-лимфоцитов и плазматических клеток [12, 40]. 
Анализ литературы показал, что часть авторов склоняется к ведущей роли активации или анергии В-лимфоцитов в патогенезе саркоидоза, а другие связывают более тяжелое течение саркоидоза с гиперактивацией В-звена иммунитета и образованием антицитруллиновых аутоантител. Косвенным подтверждением правомочности последнего положения являются положительные результаты включения таргетной анти-В-клеточной терапии ритуксимабом в общую схему лечения больных саркоидозом [9, 11]. 
Необходимы объективные критерии для сопоставления иммунологических параметров и клинико-лабораторных показателей активности заболевания с целью выбора возможных предикторов спонтанной ремиссии заболевания вследствие активации иммунорегуяторных механизмов, направленных на сдерживание гиперчувствительных реакций в пораженных органах и тканях. Назначение иммуносупрессивной терапии у таких больных может исключить возможность развития спонтанной ремиссии.
Наряду с существующими, но не оптимальными, клиническими и инструментальными критериям активности саркоидоза, существуют лабораторные критерии, которые носят дискутабельный характер. Следует отметить, что в целом в настоящее время лабораторные критерии постановки диагноза «саркоидоз» отсутствуют. Ранее для оценки активности саркоидоза широко использовали так называемый иммунорегуляторный индекс, представляющий соотношение Т-хелперов и Т-цитотоксических лимфоцитов в бронхоальвеолярном лаваже. В последние десятилетия в качестве возможных диагностических маркеров саркоидоза изучены новые показатели, в том числе растворимый рецептор интерлейкина-2 (sIL-2), хитотриозидаза, сывороточный амилоид А и ряд других. Однако критериев, соответствующих «золотому стандарту лабораторной диагностики» с целью более ранней постановки диагноза «саркоидоз», в настоящее время не существует [14, 15, 17, 21, 22]. 
Одним из лабораторных критериев, успешно применяющихся для оценки активности саркоидоза, является уровень ангиотензин-конвертирующего фермента (АПФ) в периферической крови больных. Исследования, посвященные изучению содержания АПФ свидетельствуют, что при одних заболеваниях (саркоидоз, фиброзирующий альвеолит, пневмония) этот показатель может существенно повышаться, а при других (туберкулёз, муковисцидоз) - напротив, снижаться по сравнению с нормой [13, 15, 17, 26].  
Изначально АПФ является мембранносвязанным белком, экспрессирующимся на поверхности многих типов клеток, а в циркуляцию АПФ попадает в результате протеолитического расщепления. У здоровых уровень АПФ в сыворотке крови составляет менее 70 (ACE Unit).  В норме АПФ выполняет целый ряд важных функций.   Металлопротеиназа АПФ катализирует выработку ангиотензина II путем превращения из ангиотензина I, инактивирует брадикинин через ренин-ангиотензиновую систему и, тем самым участвует в поддержании артериального давления. Наряду с функцией контроля показателей артериального давления, АПФ участвует в развитии тканей почки, эритропоэзе, миелопоэзе и развитии иммунных ответов [10]. 
    В патологических условиях фермент может избыточно продуцироваться альвеолярными макрофагами и гранулоцитами.  Считается, что основными продуцентами АПФ в гранулеме при саркоидозе служат эпителиоидные клетки, образующиеся из гиперактивированных провоспалительными цитокинами макрофагов. Поскольку сывороточный АПФ происходит в основном из микроциркуляторного русла легочной ткани, при развитии активного гранулематозного воспаления при саркоидозе в кровоток попадает существенно большее количество АПФ [17, 27, 47].  У детей младшего возраста уровень АПФ варьирует, по этой причине этот биомаркер обычно не используют в клинической практике [1].  
У взрослых повышенные уровни АПФ при саркоидозе коррелируют с распространенностью гранулематозного процесса в различных органах и тканях и с тяжестью заболевания [27]. Таким образом, высокие уровни АПФ в сыворотке крови больных саркоидозом используют в качестве маркера активности заболевания [19, 33, 36, 38, 45]. 
	 Целью настоящего исследования явилось изучение особенностей субпопуляций В-лимфоцитов в периферической крови больных с хроническим течением саркоидоза в зависимости от активности заболевания.
Материалы и методы.
Объектом исследования служила венозная кровь, полученная путем пункции периферической вены и собранная в вакуумные пробирки с содержанием K3ЭДТА, больных хроническим дебютом саркоидоза (n=41) в возрасте 20-65 лет, не получавших иммуносупрессивную терапию, в том числе системные кортикостероиды, и плазмаферез. Все больные саркоидозом проходили обследование на базе клиники НИИ интерстициальных и орфанных заболеваний легких при ФГБОУ ВО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова» Минздрава России. Диагноз саркоидоз был подтвержден с помощью гистологического исследования у 85% (35/41) больных и по клинико-рентгенологическим данным у 15% (6/41) больных. В качестве контроля использовали образцы периферической крови 43 практически здоровых лиц, сопоставимых по полу и возрасту с обследованными больными саркоидозом. Все исследования были проведены с информированного согласия испытуемых и в соответствии с Хельсинкской декларацией Всемирной ассоциации «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека» с поправками 2000 г. и «Правилами клинической практики в Российской Федерации», утвержденными Приказом Минздрава РФ от 19.06.2003 г. № 266.
Анализ иммунологических параметров проводили в сопоставлении с активностью заболевания, определяемой по ряду клинических, инструментальных и лабораторных показателей. При обследовании больных учитывались появление жалоб, симптомов, системности поражений в разных органах, увеличение давления в легочной артерии (pЛА, мм.рт.ст.) по данным эхокардиографического исследования (ЭХО-КГ), увеличение лимфоузлов, нарастание изменений в легочной ткани, распространенности очагов поражений, появление и прогрессирование признаков фиброза и другие проявления неблагоприятного течения саркоидоза по данным мультиспиральной компьютерной томографии (МСКТ), изменения показателей функции внешнего дыхания,  том числе оценивали снижение диффузионной способности легких (DLCO, %).
В качестве лабораторного показателя активности использовали определение уровня АПФ. Активность АПФ определялась  в сыворотке крови и измерялась в единицах активности ACE Unit (=1IU/ml) с помощью колориметрического теста с пептидным субстратом. Положительным считался результат активности АПФ больше 70 ACE Unit, референсные значения для лиц старше 18 лет составляли 20-70 ACE Unit.
Все лабораторные исследования проводились в день взятия крови. Подготовку образцов периферической крови и настройку проточного цитофлуориметра проводили в соответствии с рекомендациями, изложенными С.В. Хайдуковым и соавторами [4]. Для выявления популяции В-лимфоцитов периферической крови использовали антитела против CD45 (клон J33, кат. № A96416) и CD19 (клон J3-119, кат. № A94681), конъюгированными с Krome Orange и APC-AlexaFluor750, соответственно. Для анализа распределения В-лимфоцитов по основным субпопуляциям применяли антитела против поверхностных IgD (клон IA6-2, кат. № B30652), CD38 (клон LS198-4-3, кат. № A07779) и CD27 (клон 1A4CD27, кат. № A54823), конъюгированными с FITC, PE и PC7, соответственно. Все использованные в работе антитела были производства Beckman Coulter Inc. (США). Окраску антителами производили в соответствии с рекомендациями производителя. Удаление эритроцитов из образцов осуществляли при помощи коммерческого лизирующего раствора VersaLyse (кат. № A09777), к 975 мкл которого ex tempore добавляли 25 мкл фиксирующего раствора IOTest 3 Fixative Solution (кат. № A07800). По завершении инкубации образцы однократно отмывали от несвязавшихся антител избытком забуференного фосфатами физиологического раствора (7 минут при 330g), а полученный клеточный осадок ресуспендировали в 200 мкл забуференного фосфатами физиологического раствора, содержавшем 2% нейтрального параформальдегида (кат. № HT5011, Sigma-Aldrich, США). Анализ образцов проводился при помощи проточного цитофлуориметра Navios (Beckman Coulter, Inc., USA), оснащенного тремя лазерам с длинами волн излучения 405, 488 and 638 нм. В каждом образце анализировалось не менее 5000 CD19+ В-лимфоцитов периферической крови. 
Выявления основных стадий дифференцировки В-лимфоцитов производили на основе анализа ко-экспрессии IgD и CD38, а также IgD и CD27, как это было описано нами ранее [3]. 
Окраска антителами против IgD и CD38 позволяет идентифицировать следующие популяции В-клеток:
•	“наивные” Bm1 клетки с фенотипом IgD+CD38-, 
•	“активированные наивные” Bm2 клетки (IgD+CD38+),
•	Bm2’ – клетки-предшественники В-клеток зародышевых центров периферических лимфоидных органов (IgD+CD38++),
•	общая субпопуляция, включающая в себя центробласты и центроциты – так называемые “Bm3+Bm4” клетки (IgD–CD38++),
•	клетки ранней памяти eBm5 (IgD–CD38+),
•	покоящиеся клетки памяти Bm5 (IgD–CD38-).
 Оценка ко-экспрессии IgD и CD27 позволяет разделить общий пул В-лимфоцитов на «наивные» клетки с фенотипом IgD+CD27 - и три типа В-клеток памяти:
•	 клетки памяти с не переключенным классом синтезируемых антител (так называемые “unswitched” memory, IgD+CD27+), 
•	клетки памяти с переключенным классом синтезируемых антител (так называемые “class-switched” memory, IgD–CD27+), 
•	так называемые «дважды-негативные» клетки памяти (IgD–CD27–).
Метод позволяет также определять субпопуляции циркулирующих предшественников плазматических клеток с фенотипом IgD–CD27++. 
Обработку цитофлуориметрических результатов проводили при помощи программ Navios Software v.1.2 и Kaluza™ v.1.2 (Beckman Coulter, США). Статистическую обработку проводили при помощи пакетов программ Statistica 8.0 (StatSoft, США) и GraphPad Prism 4.00 for Windows (GraphPad Prism Software Inc., США). Полученные результаты по относительному и абсолютному содержанию В-лимфоцитов различных популяций приводили в виде медианы (Ме) и интерквартильного размаха (Q25 и Q75). Для сравнения полученных выборок использовали непараметрический критерий Манна-Уитни, корреляционный анализ проводили с использованием коэффициента ранговой корреляции r-Спирмена.
Результаты.
	Активность АПФ в группе больных саркоидозом была выше нормы (более 70 ACE Unit) в 63% (26/41) случаев, нормальный уровень АПФ отмечался у 37 % (15/41). В соответствии с этим нами были выделены две основные подгруппы пациентов: I подгруппа - больные с нормальным уровнем АПФ, II подгруппа - больные с повышенным уровнем АПФ в сыворотке крови.
У больных саркоидозом с нормальными показателями АПФ жалобы и симптомы были минимальными, и отмечались лишь у 6 из 15 (40%), в то время как у больных II подгруппы с высокими уровнями АПФ выраженные клинические проявления активности заболевания, том числе, указывающие на наличие системности патологического процесса, отмечались у 23 из 26 обследованных (88%).
В таблице 1 представлено сравнение клинических проявлений активности заболевания в подгруппах обследованных пациентов.
При оценке относительного и абсолютного числа CD19+ В-лимфоцитов в периферической крови больных саркоидозом и у здоровых лиц достоверных различий не выявлено. Относительное число CD19+ клеток у пациентов составило 14,20% (9,98; 17,18), у здоровых - 13,78% (9,71; 15,48) от общего числа циркулирующих лимфоцитов, соответственно (р=0,364), абсолютное число CD19+ клеток составило 209 кл/мкл (119; 285) и 234 кл/мкл (163; 305), соответственно (р=0,229).
В таблице 2 представлены данные субпопуляционного состава В-лимфоцитов, полученные на основе “Bm1-Bm5” классификации. 
У больных саркоидозом среди всех В-лимфоцитов было достоверно выше относительное число Bm2 «активированных «наивных» клеток» (IgD+CD38+), чем у условно здоровых лиц, 65,38% против 55,66%, (р <0,001). 
Относительное и абсолютное содержание eBm5 (IgD-CD38+) и Bm5 (IgD-CD38–) клеток памяти было достоверно ниже в группе больных саркоидозом относительно группы контроля. Относительные значения составили 6,59% против 13,31%, (р <0,001), и 3,43% против 8,49%, (р <0,001), соответственно.
Проведение корреляционного анализа выявило зависимость между повышением уровня АПФ и приростом относительного содержания В-клеток в рамках общего пула циркулирующих лимфоцитов у больных саркоидозом (r=0,316 при р=0,044).
Результаты корреляционного анализа субпопуляций В-лимфоцитов и активности АПФ приведены на рисунке 1. 
Показано, что при повышенном уровне АПФ в периферической крови больных достоверно снижено число «наивных» Bm1 клеток с фенотипом IgD+CD38– и покоящихся В-клеток памяти популяции Bm5 с фенотипом IgD–CD38– (r=–0,557 при р<0,001 и r=–0,324 при р=0,039, соответственно).  При этом абсолютное число «активированных «наивных» В-лимфоцитов» популяции Bm2 (r=0,337 при р=0,031) и клеток-предшественников В-лимфоцитов зародышевых центров периферических лимфоидных органов с фенотипом IgD+CD38++ повышено (r=0,355 при р=0,029).
Относительное и абсолютное число субпопуляций В-лимфоцитов, выделяемых на основании “Bm1-Bm5” классификации, у больных саркоидозом с нормальным (I подгруппа) и повышенным (II подгруппа) уровнями активности АПФ, а также в группе контроля, представлены в таблице 3. 
Было отмечено, что относительное и абсолютное содержание «наивных» Bm1 клеток (IgD+CD38–) достоверно ниже как у пациентов с нормальной, так и с высокой активностью АПФ относительно контрольной группы.
 Количество Bm2 «активированных «наивных» клеток» с фенотипом IgD+CD38+ достоверно повышено в обеих группах больных саркоидозом по сравнению с контрольной группой: 62,77% против 55,66%, (p=0,02), и 68,82% против 55,66%, (p<0,001). Относительное и абсолютное содержание eBm5 (IgD-CD38+) и Bm5 (IgD-CD38–) клеток памяти было достоверно ниже в группе больных саркоидозом как с нормальной, так и высокой активностью АПФ относительно группы контроля (p<0,001).
Анализ субпопуляционного состава В-лимфоцитов периферической крови больных хроническим саркоидозом и практически здоровых лиц, на основе “IgD – против – CD27” классификации, представлен в таблице 4.
 Следует отметить, что относительное содержание «наивных» IgD+CD27– клеток среди общей популяции CD19+ лимфоцитов было достоверно выше у больных саркоидозом и составило 81,35%, в то время как в группе контроля – 60,91%, (р<0,001). При этом число В-клеток памяти и клеток-предшественников клеток памяти в образцах крови больных саркоидозом относительно контроля было снижено. Относительное содержание В-клеток памяти, не переключивших класс синтезируемых антител (IgD+CD27+) в группе больных было снижено и составило 6,25%, а в группе контроля - 12,95% (р<0,001). Число клеток памяти, переключивших класс синтезируемых антител (IgD–CD27+), было также существенно снижено у больных саркоидозом и составило 6,75% против 16,50% в контрольной группе (р<0,001). Содержание «дважды негативных» клеток с фенотипом IgD–CD27– составило 3,07% и 4,77% в исследованных группах соответственно, (р<0,001).
Результаты анализа зависимости между уровнем сывороточного АПФ и различными популяциями В-лимфоцитов периферической крови, выявленных на основании ко-экспрессии IgD и CD27, приведены на рисунке 2. 
Так, у больных с повышенным уровнем АПФ, отмечалось увеличением не только относительного содержания «наивных» В-клеток с фенотипом IgD+CD27– (r=0,532 при р<0,001), но и их концентрации (r=0,375 при р=0,016). Интересно, что между числом В лимфоцитов, принадлежащих к популяции В-клеток памяти с фенотипами IgD+CD27+ и показателями уровня АПФ была установлена обратная зависимость (r=–0,565 при р<0,001 и r=–0.357 при р=0,022, соответственно).
Относительное и абсолютное содержание разных субпопуляций В-лимфоцитов, выделяемых на основании экспрессии IgD и CD27, у больных саркоидозом с нормальным и повышенным уровнями активности АПФ, а также в группе контроля, представлены в таблице 5. 
Так, среди всех CD19+ клеток у больных хроническим течением саркоидоза, как с высокой, так и с низкой активностью АПФ, было достоверно повышено число «наивных» клеток (IgD+CD27–) относительно контрольной группы. Значения составили 75,47% в группе пациентов с нормальными значениями АПФ и 85,04% при высоких уровнях АПФ относительно 60,91% в образцах контрольной группы (p<0,001). 
 Количество В-клеток памяти и клеток-предшественников клеток памяти в образцах крови больных саркоидозом было снижено в группе как с нормальной, так и повышенной активностью АПФ, относительно образцов группы контроля. Относительное содержание В-клеток памяти, которые ещё не переключили класс синтезируемых антител (IgD+CD27+) в первой группе больных составило 11,43%, во второй группе больных - 5,48%, что было достоверно ниже, чем в группе контроля - 12,95%, при p1-3=0,035 и p2-3<0,001, соответственно. Количество клеток памяти, переключивших класс синтезируемых антител (IgD–CD27+) составило 7,35% и 5,53% у пациентов с нормальной и высокой активностью АПФ, эти показатели были достоверно ниже у больных саркоидозом по сравнению с контрольной группой (16,50%), р<0,001.
 Относительное число В-лимфоцитов с фенотипами IgD+CD27+ и IgD–CD27+ было достоверно снижено в группе больных с высоком уровнем АПФ относительно группы больных с нормальным уровнем АПФ при p1-2=0,003 и p1-2=0,026, соответственно.
Обсуждение.
Для клинико-иммунологических сопоставлений необходимы объективные критерии, позволяющие оценить активность воспалительного процесса, особенности клинического течения, эффективность проводимой терапии, прогноз заболевания. 
 Комплексность оценки наиболее значимых клинико-иммунологических показателей с целью поиска предикторов спонтанной ремиссии, риска рецидива заболевания, исхода воспалительного процесса в стадию фиброза, обычно проводят с помощью ретроспективного анализа. В данной работе стояла задача анализа изменений изучаемых субпопуляций В-лимфоцитов в крови больных первично-хроническим саркоидозом в зависимости от степени активности заболевания. 
Поскольку АПФ секретируется эпителиоидными клетками, активированными макрофагами, и его уровень в сыворотке крови коррелирует с объемом гранулем, многие авторы отмечают правомерность использования этого параметра для оценки вероятности развитии фиброза легких при системном саркоидозе, а также при саркоидоз-ассоциированном увеите [6, 19, 35].  
В настоящем исследовании выполнен анализ целого ряда клинико-лабораторных параметров (таблица 1), и обнаружено, что уровень АПФ, наряду с другими показателями, может служить для объективизации оценки активности хронического воспалительного процесса. Среди обследованных нелеченых кортикостероидными препаратами больных саркоидозом с первично-хроническим течением заболевания, были выделены две подгруппы. В первую подгруппу вошли 15 пациентов с менее выраженными показателями активности патологического процесса и с нормальным уровнем АПФ в крови, во вторую подгруппу - 26 пациентов с повышенным уровнем АПФ и более выраженными, по сравнению с первой группой, клиническими изменениями, оцениваемыми по объективным критериям (табл.1). 
 Такое распределение пациентов на группы сравнения способствует более четкому анализу возможной патогенетической и клинико-диагностической значимости изучаемых в работе иммунологических параметров.
Достоверность различий в числе разных субпопуляций В-лимфоцитов, циркулирующих в периферической крови больных саркоидозом, а также сравнение этих показателей с числом В-лимфоцитов на разной стадии дифференцировки у здоровых лиц, позволило сделать предположения об особенностях гуморального звена иммунитета у больных с первично-хронической формой саркоидоза при разной степени активности заболевания.
 Выполненные в работе исследования не являются рутинными, однако полученные данные способствуют выбору наиболее информативных для клинической практики форматов при изучении субпопуляций лимфоцитов крови с использованием “Bm1-Bm5” классификации, или на основании экспрессии молекул IgD и CD27 на поверхности В-клеток.
Как видно из таблицы 2, при анализе субпопуляций В-лимфоцитов с помощью маркеров “Bm1-Bm5” классификации, в целом по группе всех обследованных больных саркоидозом (n=41), содержание изученных субпопуляций в крови отличалось по большинству параметров от показателей у здоровых лиц, за исключением “Bm3+Bm4” лимфоцитов с фенотипом IgD–CD38++, представляющих общую субпопуляцию центроцитов и центробластов, присутствующих, в основном, во вторичных органах иммунитета. 
Большинство исследуемых показателей у больных саркоидозом было снижено относительно группы контроля, к их числу относились абсолютные значения Bm1, IgD+CD38– В-лимфоцитов, eBm5, IgD-CD38+ В-лимфоцитов и Bm5, IgD-CD38–, в то время как число Bm2' клеток с фенотипом IgD+CD38++ было достоверно повышено относительно здоровых лиц (табл.2).
Таким образом, в целом по группе обследуемых больных с первично-хроническим течением саркоидоза, до начала применения иммуносуперссивной терапии, отмечается выраженная анергия В-клеточного звена иммунитета. Полученные данные могут свидетельствовать о компартментализации В-звена иммунного ответа с преобладанием клеток в очагах поражения и с выраженной анергией на периферии. 
Повышенное число В-лимфоцитов с фенотипом IgD–CD38++, представляющих собой общую субпопуляцию центробластов и центроцитов (“Bm3+Bm4” клетки) (IgD–CD38++), также подтверждают эту гипотезу. Как известно, такие же закономерности перераспределения клеток в пораженные ткани из периферической крови отмечаются и для Т-лимфоцитов у больных саркоидозом, при этом на периферии отмечается выраженная анергия Т-звена.
Данные анализа субпопуляций В-лимфоцитов крови в группах больных саркоидозом с разной степенью активности заболевания, представленные в таблице 3. Оказалось, что   абсолютные значения большинства исследуемых субпопуляций В-лимфоцитов («активированных «наивных» В-лимфоцитов (Bm2), клеток-предшественников В-лимфоцитов зародышевых центров периферических лимфоидных органов (Bm2'), а также двойных негативных Bm5) при более активном патологическом процессе (у больных II подгруппы)  достоверно выше, по сравнению с первой  группой больных с менее активным воспалительным процессом. 
      Эти выводы согласуются также с полученными данными о достоверном снижении числа Bm1-наивных клеток, а также eBm5 -покоящихся В-клеток памяти в периферической крови больных с более активно протекающем заболевании (II подгруппа) по сравнению с первой подгруппой пациентов с признаками менее активного воспаления (табл.3). 
Таким образом, полученные данные указывают на активное участие В-лимфоцитов в патогенезе саркоидоза, поскольку при активации воспаления отмечается выраженная активация и В-звена иммунитета, а по мере прогрессирования заболевания снижается число наивных В-лимфоцитов и покоящихся В-клеток памяти в крови.
При использовании метода оценки распределения субпопуляций В-лимфоцитов с помощью маркеров IgD и CD27, получены данные, представленные в таблицах 4 и 5. 
В целом по группе обследованных больных саркоидозом (n=41) по сравнению с группой здоровых (n=43), установлено снижение абсолютного числа наивных В-лимфоцитов с фенотипами IgD+CD27+, а также В-лимфоцитов памяти, переключивших изотип иммуноглобулинов   и двойных негативных В-лимфоцитов памяти (табл.4).
Данные о снижении числа   В-лимфоцитов совпадают с полученными результатами при использовании классификации “Bm1-Bm5” и указывают, что в целом по группе обследуемых больных с первично-хроническим течением саркоидоза, до начала применения иммуносуперссивной терапии, отмечается анергия В-клеточного звена иммунитета. Обращает на себя внимание достоверное снижение процента В-лимфоцитов памяти, не переключивших изотип иммуноглобулинов (IgD+CD27+) и В-лимфоцитов-памяти, переключивщих изотип (IgD–CD27+) в периферической крови у обследованных больных саркоидозом II подгруппы по сравнению с больными I подгруппы с менее активным воспалительным процессом (табл.5). Полученные результаты косвенно могут свидетельствовать о перераспределении субпопуляций В-лимфоцитов памяти из периферической крови в очаги воспаления и также указывает на роль В-звена иммунитета в патогенезе саркоидоза 
При использовании оценки ко-экспрессии молекул IgD и CD27 для характеристики субпопуляционного состава В-лимфоцитов периферической крови у больных саркоидозом, при подсчете абсолютного числа клеток достоверных различий между группами больных саркоидозом выявлено не было, в отличии от ранее полученных данных при использовании маркеров “Bm1-Bm5” (табл.3 и табл.5). 
По-видимому, определение субпопуляций В-лимфоцитов крови с помощью классификации маркеров “Bm1-Bm5” является более информативным, по сравнению с определением ко-экспрессии молекул IgD и CD27 для обследованных групп больных с хроническим течением саркоидоза при разной степени активности заболевания. 
 	При анализе данных литературы отмечены совпадения с нашими данными. Так, Lee N.S. и соавторы отметили выраженное снижение числа CD27+ В-клеток памяти у пациентов с тяжелым течением хронического саркоидоза и В-клеточную лимфопению [31]. Изменения в составе В-лимфоцитов периферической крови на разных стадиях дифференцировки и сниженное число В-клеток памяти у пациентов с активным хроническим саркоидозом описано и другими авторами [41]. Повышенное число «активированных наивных» В-лимфоцитов с фенотипом IgD+CD38+, сравнительно недавно получивших сигнал активации от В-клеточного рецептора в крови больных саркоидозом, позволяет выдвинуть гипотезу о том, что антигены, вызывающие активацию В-лимфоцитов, постоянно персистируют в организме у таких больных. К числу этиологически значимых антигенов при саркоидозе могут относиться фрагменты внутриклеточно-паразитирующих микроорганизмов, например, P.acnes, или ряда других.  
Анализ взаимосвязи между числом определяемых субпопуляций В-лимфоцитов и уровнем АПФ в крови больных саркоидозом также подтвердил информативность предложенного в данной работе подхода к разделению больных на две группы - с менее активным (подгруппа I) и более активным (подгруппа II) воспалительным процессом. 
Установлены достоверные зависимости между числом клеток, принадлежащих к разным субпопуляциям В-лимфоцитов крови и значениями активности АПФ (Рис.1-2): 
•	Обратная зависимость, r=–0,557 при p<0,001, между относительным числом «наивных» Bm1 клеток (IgD+CD38−) и уровнем  АПФ (Рис.1А);
•	Прямая зависимость, r=0,532 при p<0,001, между относительным числом «наивных» клеток с фенотипом IgD+CD27 – и уровнем АПФ (Рис.2А);
•	Обратная зависимость, r=–0,565 при р<0,001,  между относительным числом В-клеток памяти, «не переключивших» класс синтезируемых антител (IgD+CD27+) и уровнем АПФ (Рис.2В).
Данных о сравнении субпопуляционного состава В-лимфоцитов в сопоставлении с активность саркоидоза в современной литературе крайне мало. 
В исследовании Ando M. и соавторов проводится сравнение ряда лабораторных маркеров с активностью и тяжестью течения саркоидоза. Отмечается, что уровень BAFF (от англ. «B-cell activating factor») в сыворотке крови достоверно коррелирует с активностью саркоидоза, тяжестью заболевания и уровнем АПФ, как одного из лабораторных маркеров активности заболевания [5, 7, 44]. Активирующий фактор BAFF относится к TNF семейству и необходим для развития и нормального функционирования В-лимфоцитов. Он играет важную роль в выживании, дифференцировке клеток и дальнейшей продукции антител. В экспериментальных работах показано, что чрезмерная экспрессия BAFF приводит к активации В-  и Т-лимфоцитов, гипергаммаглобулинемии и отложению иммунных комплексов [42]. Блокировка передачи сигнала от сывороточного BAFF на В-клетки при помощи таргетной терапии с применением моноклональных антител к рецептору BAFF (анти-BAFF-R mAb) резко снижает число В-лимфоцитов как фолликулярных, так и маргинальной зоны in vivo [39]. Следует отметить, что определение уровня BAFF в крови больных саркоидозом не является рутинным исследованием.
К числу новых лабораторных маркеров активности саркоидоза также относятся растворимый рецептор интерлейкина-2 (sIL-2), хитотриозидаза, сывороточный амилоид А, однако показано, что именно АПФ является по-прежнему наиболее информативным для оценки активности саркоидоза, поскольку его уровни коррелируют с клиническими критериями – проявлениями системности и нарастанием изменений на МСКТ [19, 27, 36, 45]. 
Изучение особенностей активации гуморального звена иммунитета может способствовать не только более полному пониманию механизмов иммунопатогенеза саркоидоза и роли В-лимфоцитов, но, возможно, со временем, будет служить обоснованием для выработки критериев назначения таргетной иммунотерапии.
Таргетная терапия достаточно в редких случаях применяется при лечении саркоидоза и в основном «of label».  Поскольку известно, что Т-механизмы гиперчувствительности, наряду с активацией В-звена иммунитета, играют важнейшую роль в патогенезе саркоидоза, ряд авторов указывают на необходимость использования в терапии саркоидоза препаратов, обеспечивающих снижение гиперактивных Т-клеточных ответов. Известно, что в процессе гранулемообразовании при саркоидозе  гиперактивированные интерфероном гамма и фактором некроза опухоли-альфа макрофаги сливаются в гигантские клетки воспаления, в этой связи препарат инфликсимаб,  представляющий собой  моноклональные антитела к фактору некроза опухоли, мог бы существенно снизить активность гиперчувствительных Т-клеточных иммунных ответов в пораженных тканях у больных саркоидозом. 
В последние годы появились работы, свидетельствующие о благоприятном таргетном воздействии и на В-лимфоциты при ряде заболеваний. Терапия с помощью анти-CD20 моноклональных антител приводит к положительному клиническому эффекту при таких классических аутоиммунных заболеваниях, как системная красная волчанка и ревматоидный артрит. Показан также положительный клинический эффект такой терапии при тяжелых формах саркоидоза, нейросакоидозе, саркоидозе с поражением глаз, сердца [6, 9, 11, 16, 18, 30]. Эти данные успешной таргетной иммунотерапии больных саркоидозом с использованием анти-CD20 моноклональных антител (препарат ритуксимаб), подтверждают важную патогенетическую роль гуморальных механизмов при хроническом течении заболевания с проявлениями системности поражений.
Belkhou A. и соавторами описали случай применения ритуксимаба в качестве альтернативного лечения больной саркоидозом при неэффективности применения системных кортикостероидов. Авторы описывают улучшение клинического состояния пациентки: снижение интенсивности суставных проявлений, снижение астении, нормализацию легочных функциональных тестов [9].
Другая группа авторов описала случай применения ритуксимаба (анти-CD20) после отмены проведенной терапии метотрексатом и инфликсимабом (анти-TNFα) у пациентки с саркоидозом с поражением легочных, медиастинальных, брыжеечных, перитонеальных лимфатических узлов и высокой активностью АПФ. Отмечалось улучшение состояния больной, нормализация уровня АПФ, уменьшения размеров легочных и перитонеальных лимфатических узлов [18]. Cinetto F. и соавторы отмечают снижение прогрессирования поражения легких при хроническом рефрактерном саркоидозе и возможности отмены системных кортикостероидов с течением времени [16]. У больных нейросаркоидозом ритуксимаб может быть рекомендован при устойчивости к кортикостероидам и другим обычно используемым методам супрессивной иммунотерапии [11]. Применение ритуксимаба также показано при саркоидозе с поражением глаз в качестве альтернативного подхода, при резистентности к другим методам лечения, или при наличии противопоказаний к терапии кортикостероидами [6]. 
В заключении следует отметить, что полученные данные свидетельствуют о важной роли В-клеточного иммунного ответа в патогенезе саркоидоза и дают возможность оценить особенности гуморального ответа при разной степени активности заболевания. 
В дальнейшем необходимы более углубленные клинико-иммунологических сопоставления, основанные на многофакторном анализе показателей активности заболевания с целью разработки возможных клинико-иммунологических критериев оценки эффективности терапии саркоидоза и своевременной ее коррекции, возможно, с использованием таргетной иммунотерапии.